دستگاه الکتروفورز

الکتروفورز از شناخته شده ترین روش های آزمایشگاهی برای جداسازی بیومولکول ها است. این روش در سال ۱۸۰۷ توسط Reuss کشف شد. او مشاهده کرد که ذرات خاک رس تحت تاثیر میدان الکتریکی در آب پراکنده می شوند. به طور کلی الکتروفورز حرکت ذرات پراکنده در داخل مایعی تحت تاثیر یک میدان الکتریکی یکنواخت است. همین حرکت در فضایی با میدان الکتریکی غیر یکنواخت دی الکتروفورز نامیده می شود. الکتروفورز بدین دلیل اتفاق می افتد که ذرات معلق در مایع معمولا دارای بار الکتریکی سطحی هستند و میدان الکتریکی نیروی کولونی الکترواستاتیک به این ذرات باردار اعمال می کند. اخیرا شبیه سازی های دینامیک مولکولی، نظریه ای بیان داشته اند مبنی بر اینکه برای انجام الکتروفورز حتما نباید ذرات بار سطحی داشته باشند و حتی ذرات خنثی نیز به علت ساختار مولکولی خاصی که آب به عنوان مایع واسط دارد، می توانند الکتروفورز شوند. نیروی کولونی الکترواستاتیک اعمال شده به بار سطحی، با نیروهای مخالف الکترواستاتیک کاهش پیدا می کند. بر طبق تئوری لایه مضاعف، تمام سطوح بار دار در مایعات با لایه ای از بار مخالف پوشانده می شوند که از نظر مقداری کاملا برابر با بار سطحی است اما با علامت مخالف آن. میدان الکتریکی همانند بار سطحی به این لایه نیرو وارد می کند. مجموع این نیروها برابر است با اولین نیروی نامبرده، اما در جهت مخالف آن. در حقیقت این نیرو به یون های موجود در لایه ثانویه اعمال می شود. این یون ها در فاصله ای از سطح ذره قرار می گیرند و بخشی از این نیروی الکترواستاتیک را از طریق تنش برش سیال به سطح ذره منتقل می کنند این بخش از نیرو که به بدنه ذره وارد می شود، نیروی منفی الکتروفورتیک نامیده می شود. یک نیروی الکتریکی دیگر نیز وجود دارد که مرتبط با انحراف لایه ثانویه است و مربوط به تقارن کروی و رسانایی سطح است و به سبب زیادی یون ها در لایه ثانویه به وجود می آید. این نیرو نیروی تخفیف الکتروفورتیک نامیده می شود. تمام این نیروها با اصطکاک هیدرودینامیک، به تعادل می رسند و باعث حرکت ذرات در سیال می شود. سرعت این حرکت v، متناسب با شدت میدان الکتریکی E است (البته در صورتی که این میدان خیلی قوی نباشد.) ضریب این تناسب تحرک پذیری الکتروفورتیک است که رابطه بین شدت میدان الکتریکی و سرعت ذره را مشخص می نماید: ماکرومولکول هایی مانند اسید نوکلئیک، DNA و پروتئین ها نیز باردار هستند و می توان با قرار دادن آن ها در یک میدان الکتریکی، بر مبنای خاصیت الکتروفورز آن ها را تفکیک کرد. سرعت حرکت مولکول ها در این شرایط نه تنها تحت تاثیر بار الکتریکی و شدت میدان الکتریکی است، بلکه عواملی نظیر اندازه، وزن مولکولی و شکل فضایی مولکول نیز در این امر دخیل هستند. همچنین اثرات محیطی نظیر نوع و نحوه استفاده از بافرها و حرارت ایجاد شده در حین کار نیز از عوامل موثر بر جداسازی مولکول های نمونه هستند. معمولا الکتروفورز برای تفکیک مولکول های بزرگی چون پروتئین ها و اسیدهای نوکلئیک به کار برده می شود، اما در مواردی نیز برای جداسازی مولکول های باردار کوچک تر نظیر قندها، اسیدهای آمینه، پپتیدها و حتی یون های ساده مورد استفاده قرار می گیرد. در طی قرن ۲۰ میلادی چندین تئوری برای محاسبه این پارامتر به وجود آمده اند. که مهم ترین آن ها نظریه Smoluchowski در سال ۱۹۰۳ میلادی بود. Arne Tiselius در سال ۱۹۴۸ به خاطر زحماتی که برای الکتروفورز و آنالیز جذبی کشید برنده جایزه نوبل شد و از این رو او را پدر الکتروفورز نامیدند. اولین الکتروفورز نیز الکتروفورز بدون مرز تیسلیوس نام داشت که به وسیله آن محلول های پروتئینی غلیظ را در یک تیوب U شکل بزرگ که به وسیله بافر پوشانده شده بود، مورد آزمایش قرار می دادند. این روش الکتروفورز بسیار مشکل بود، به همین دلیل در سال ۱۹۵۰ تغییراتی در عملکرد آن اعمال شد. ابتدا از فیلترهای کاغذی و استات سلولز استفاده می شد، اما به دلیل ظرفیت محدود و رزولوشن پایین این مواد، جای خود را به ژل دادند. ژل های استفاده شده در آن زمان به علت بزرگ بودن خلل و فرج ها قادر نبودند پروتئین ها را به تفکیک سایز جداسازی کنند، از این رو به تدریج به ژل هایی چون آگاروز دست یافتند. امروزه الکتروفورز ژلی از بخش های جدا ناپذیر هر تحقیق و فعالیت های آزمایشگاهی به منظور جداسازی ماکرومولکول هااست. محدوده وسیعی از فعالیت های آزمایشگاهی تحقیقاتی و کلینیکی مانند تسلسل ژن ها، جداسازی کروموزوم ها، جداسازی و تعیین خصوصیات پروتئین ها توسط این روش انجام می گیرد. علاوه بر این، استفاده از الکتروفورز از مرز آزمایشگاه ها فراتر رفته و به عنوان شاهدی برای وکلا، قضات و هیات منصفه در امور قضایی محسوب می شود. تشخیص هویت DNA به خصوص در موارد تعویض نوزاد در بیمارستان ها و تعیین والدین فرد کاربرد بسیاری در علوم ژنتیک پیدا کرده است. در حال حاضر آگاروز و پلی کریل آمید متداول ترین و پر کاربردترین ماده به عنوان واسط در الکتروفورز ژلی محسوب می شوند. در اغلب دستگاه های الکتروفورز، ژل مابین دو محفظه بافری قرار می گیرد به طوری که ژل تنها واسطه در عبور جریان الکتریسیته بین این دو محفظه باشد. هر دو شبکه خلل و فرج داری تولید می کنند که میکرومولکول هایی بارداری را که در پاسخ به میدان الکتریکی جابه جا می شوند در خود جای می دهند. به عنوان مثال زمانی که جریان اعمال می شود، DNA های با بار منفی به سمت الکترودهای باردار مثبت حرکت می کنند. خلل و فرج های موجود در شبکه ژلی انتقال مولکول های بزرگ را محدود می کنند و این در حالی است که مولکول های کوچک تر با آزادی بیشتری منتقل می شوند و در فاصله دورتری از الکترودها قرار می گیرند. این غربال مولکولی مولکول ها را بر مبنای سایزشان جدا می کند. همچنین می توان مولکول ها را بر مبنای بار اولیه ای که داشتند جداسازی کرد. مولکول هایی که بار بیشتری دارند تحرک الکتروفورزی بیشتری از خود نشان می دهند و سریع تر منتقل می شوند بدین ترتیب درون ژل با اولویت باری که داشتند قرار می گیرند. جداسازی بر مبنای بار به ژلی نیاز دارد که مانند آگاروز دارای خلل و فرج های بزرگ تری باشند. آگاروز برای جداسازی اسید نوکلئیک ها و پروتئین های خیلی بزرگ یا ترکیب ها استفاده می شود. آگاروز یک پلی ساکارید طبیعی است که از نوع خاصی جلبک دریایی قرمز به دست می آید. زمانی که گرما داده شده و سپس سرد می شود به صورت جامد متخلخلی با خلل و فرج های نسبتا بزرگ تبدیل می شود. الکتروفورز ژل آگاروز (AGE) را می توان برای جداسازی مولکول ها بر مبنای بار یا وزن مولکولی شان استفاده کرد. یکی از مهم ترین کاربردهای AGE جداسازی بخش های حاصل از برش DNA با آنزیم های محدودکننده است. در طی انجام الکتروفورز ثابت نگاه داشتن حرارت اهمیت بسیاری دارد چرا که به حفظ تکرار پذیری آزمایش کمک می کند. به عنوان مثال پلیمریزه شدن آکریل آمید یک واکنش گرمازا است و گرمای حاصله به خصوص در مورد ژل های غلیظ تر، ممکن است باعث بروز بی نظمی در اندازه ی منافذ ژل شود. انتقال گرما معمولا مشکلی در ژل هایی با غلظت کمتر از %۱۵ T ایجاد نمی کند. البته ممکن است بالا رفتن دما مشکلات دیگری چون شکستن شیشه های الکتروفورز و آسیب به دستگاه را منجر شود. پروتئین ها به علت خصوصیت آمفوتری خود تحت تاثیر pH محیط بارالکتریکی خاص خود را نشان می دهند. بدین علت در جداسازی توسط الکتروفورز باید pH محلول های مورد استفاده ثابت باقی بماند. از آنجا که الکترولیز آب در آند یون ای "H+" و در کاتود یون های "OH " ایجاد می کند، برای ثابت نگاه داشتن pH محلول های مورد استفاده، باید آن ها را بافر کرد. نوع دیگری از الکتروفورز، الکتروفورز مویین (CE) است. این تکنیک که عمده ترین کاربرد آن در شیمی دارویی و درمانی است، برای جداسازی مولکول های درشت و ریز در مجاری بسیار نازک (با قطر داخلی ۲۰۰ ۲۰میکرومتر) استفاده می شود. در این روش، جداسازی با ولتاژ بالا kV) ۳۰ ۱۰) امکان پذیر می شود. از محاسن CE می توان به سرعت دستیابی به نتیجه در آنالیز یون ها اشاره کرد. به طور کلی CE بیشتر زمانی مطرح می شود که با آنالیت های باردار با پلاریته و قطبیت زیاد سر و کار داریم. این تکنولوژی در علوم بایوتکنولوژی جایگاه ویژه ای پیدا کرده و در آنالیز ماکرومولکول هایی چون پروتئین ها و کربوهیدرات ها جایگزین خوبی برای الکتروفورز سنتی به شمار می رود. همچنین تکنولوژی CE برای سرعت بخشی به رشد علم ژنتیک به خدمت گرفته شده است. استفاده از الکتروفورز موئین در علوم تحلیلی به خصوص در زمینه دارویی و زهر شناسی رشد بسیاری داشته است. الکتروفورز موئین در بر گیرنده چندین تکنیک است که عملکرد و مشخصه های متفاوتی با هم دارند. این تکنیک ها که به مودهای الکتروفورز موئین معروف هستند عبارتند از: الکتروفورز ناحیه ای موئین (CZE) ، تمرکز ایزوالکتریک (IEF)، الکتروفورز موئین ژلی، ایزوتاکوفورز (ITP) و کروماتوگرافی الکتروسینتیک موئین. نوع دیگری از الکتروفورز که قدیمی ترین نوع این تکنیک محسوب می شود، الکتروفورز سطحی نام دارد. در این روش از یک لایه کاغذی متخلخلی با طول ۱۰ ۲۰ سانتیمتر، ترموپلاستیکی متشکل از سلولز و اسید استیک و ژل پلیمر استفاده می شود. تشخیص هویت DNA به وسیله الکتروفورز، اندازه گیری هر رشته و شمارش تعداد بخش ها و برش های تکرار شده در آن است. دانشمندان برای این کار از روش الکتروفورز ژلی استفاده می کنند. بدین ترتیب که با جریان الکتریکی رشته های DNA را از میان ژل عبور می دهند. چون هر بیت از DNA دارای بار منفی است و در معرض نیروی الکتریکی با بار برابر قرار می گیرد و آن را به سمت وجهی از ژل که بار مثبت دارد، پیش می برد. ذرات کوچک تر سریع تر حرکت می کنند. وقتی جریان برداشته می شود، از ژل تصویری گرفته می شود تا مشخص شود هر بیت چه قدر جابه جا شده است. با مقایسه باندهای ایجاد شده با نمونه های استاندارد که سایزهای شناخته شده ای دارند، طول هر بخش از DNA به دقت اندازه گیری می شود.