نخستین دوربین سه بعدی خانگی پاناسونیک

پاناسونیک، از نخستین دوربین سه بعدی خانگی پرده برداشت. این دوربین با کیفیت 1080p قادر به ضبط تصاویر است.

کوچک‌ترین فلش درایو USB سان دیسک

سان دیسک به عرضه فلش درایو USB اقدام کرده که به ادعای این شرکت سازنده حافظه، کوچک‌ترین فلش درایو USB ساخته شده در جهان است.   var divFontsArray = new Array('doc_dv5_1','doc_dv5_1 *'); var currentFontSize = 9.5; function changefSize(Wdo) { if (Wdo == 'plus') currentFontSize++; else if (Wdo == 'reset') currentFontSize = 9.5; else if (Wdo == 'minus') currentFontSize--; for (i=0; i

قرار دادن آیکون برای سایت (favicon)

حتما تا کنون تصاویر کوچک یا همان آیکون را در کنار نوار آدرس سایت در حال نمایش یا محل نمایش عنوان سایت، در برنامه مرورگر خود دیده اید، این تصویر کوچک اصطلاحا favicon نام دارد. در این مطلب قصد داریم چگونگی قرار دادن این آیکون ریز را به شما آموزش دهیم. برای انجام این کار دو مرحله باید صورت گیرد: آماده سازی آیکون – قرار دادن کد نمایش دهنده آیکون در کد قالب وبلاگ یا سایت شما شما باید ابتدا یک تصویر ۱۶ در ۱۶ پیکسل آماده کنید. این کار را می توان با استفاده از برنامه های گرافیکی و یا سایت های مخصوص ارائه favicon انجام داد.فرمت فایل تصویری شما حتی الامکان باید یکی از این فرمت ها باشد تا در مرورگر قابل نمایش باشد: ico , png , gif چنانچه با نرم افزارهای گرافیکی آشنایی ندارید یا امکان طراحی برای شما نیست ، سایت favicon.cc ‌این امکان را برای شما به راحتی میسر کرده است. کافی است به سایت مراجعه کرده و آیکون دلخواه خود را بسازید. این سایت قابلیت تبدیل تصویر مورد نظر شما به favicon را نیز دارد. با توجه به اینکه در favicon محدودیت نمایش تعداد رنگ وجود دارد ممکن است طرح شما چندان چشمگیر در نیاید، پس نمی توان از گرافیک بالا یا جزییات زیادی بهره برد. پس از طراحی در آن سایت ، فایل favicon را دانلود کنید. فایل دانلود شده بدین نام خواهد بود : favicon.ico این فایل را در یک فضا آپلود کنید و آدرس آن را در کد زیر قرار دهید: این کد را باید حتما بین عبارت های و قرار دهید (در سطر های اول کد قالب عبارت را پیدا کنید و کد آیکون را در سطر بعدی این عبارت قرار دهید) پس از انجام این مراحل ، صفحه سایت خود را باز کنید تا آیکون را در کنار آدرس سایت ( در برخی مرورگر ها هم کنار عنوان سایت) ببینید. توجه کنید که در اکثر مرورگر ها بلافاصله بعد از درج این کد در قالب ، آیکون نمایش داده می شود اما متاسفانه گاهی اوقات در مرورگر اینترنت اکسپلورر بعد از مدتی (معمولا بین ۱۰روز تا یک ماه) نمایش داده خواهد شد. برای آپلود فایل ها نیز می توانید از این سایت هم استفاده کنید که اکثر فرمت ها را پشتیبانی می کند!

قرار دادن آیکون برای سایت (favicon)

حتما تا کنون تصاویر کوچک یا همان آیکون را در کنار نوار آدرس سایت در حال نمایش یا محل نمایش عنوان سایت، در برنامه مرورگر خود دیده اید، این تصویر کوچک اصطلاحا favicon نام دارد. در این مطلب قصد داریم چگونگی قرار دادن این آیکون ریز را به شما آموزش دهیم. برای انجام این کار دو مرحله باید صورت گیرد: آماده سازی آیکون – قرار دادن کد نمایش دهنده آیکون در کد قالب وبلاگ یا سایت شما شما باید ابتدا یک تصویر ۱۶ در ۱۶ پیکسل آماده کنید. این کار را می توان با استفاده از برنامه های گرافیکی و یا سایت های مخصوص ارائه favicon انجام داد.فرمت فایل تصویری شما حتی الامکان باید یکی از این فرمت ها باشد تا در مرورگر قابل نمایش باشد: ico , png , gif چنانچه با نرم افزارهای گرافیکی آشنایی ندارید یا امکان طراحی برای شما نیست ، سایت favicon.cc ‌این امکان را برای شما به راحتی میسر کرده است. کافی است به سایت مراجعه کرده و آیکون دلخواه خود را بسازید. این سایت قابلیت تبدیل تصویر مورد نظر شما به favicon را نیز دارد. با توجه به اینکه در favicon محدودیت نمایش تعداد رنگ وجود دارد ممکن است طرح شما چندان چشمگیر در نیاید، پس نمی توان از گرافیک بالا یا جزییات زیادی بهره برد. پس از طراحی در آن سایت ، فایل favicon را دانلود کنید. فایل دانلود شده بدین نام خواهد بود : favicon.ico این فایل را در یک فضا آپلود کنید و آدرس آن را در کد زیر قرار دهید: این کد را باید حتما بین عبارت های و قرار دهید (در سطر های اول کد قالب عبارت را پیدا کنید و کد آیکون را در سطر بعدی این عبارت قرار دهید) پس از انجام این مراحل ، صفحه سایت خود را باز کنید تا آیکون را در کنار آدرس سایت ( در برخی مرورگر ها هم کنار عنوان سایت) ببینید. توجه کنید که در اکثر مرورگر ها بلافاصله بعد از درج این کد در قالب ، آیکون نمایش داده می شود اما متاسفانه گاهی اوقات در مرورگر اینترنت اکسپلورر بعد از مدتی (معمولا بین ۱۰روز تا یک ماه) نمایش داده خواهد شد. برای آپلود فایل ها نیز می توانید از این سایت هم استفاده کنید که اکثر فرمت ها را پشتیبانی می کند!منبع :http://www.bloghelp.ir/?p=149

تکنیکِ Do IT

تکنیکِ Do IT اسمِ این تکنیک از حروفِ چهار کلمه‌ی انگلیسی تشکیل شده است. علتِ انتخابِ این چهار کلمه این است که برای حلِ مشکل، ابتدا لازم است موضوع یا مسأله را دقیقاً تعریف و مشخص کنیم. سپس ذهن را برای پیدا کردنِ راه‌حل‌های مختلف باز نگه داریم تا بهترین راه پیدا شود. در زیر این کلمات را تعریف کرده‌ایم. هر یک از آن‌ها به شما دیدِ خوبی برای استفاده از این تکنیک می‌دهد. مسأله را واضح مطرح کنید. سؤال کنید چرا این مشکل به وجود آمده است؟ سعی کنید مشکل را به مشکلاتِ کوچک‌تر تقسیم کنید. حال این مشکل را در دو کلمه بیان کنید. هدف‌ها، معیارها و موانعِ کارتان را مشخص کنید و درباره‌ی آن‌ها توضیح دهید. در این مرحله با تمرکز بیشتر بر موضوع و درکِ عمیقِ آن می‌توان به تعریفِ درست‌تری از آن رسید. تعریفِ دقیقِ مسأله، به قدری به حلِ خلاقِ آن کمک می‌کند که گفته می‌شود نود درصدِ حلِ مسأله، خوب فهمیدنِ آن است. از زاویه‌های مختلف مسأله را ببینید. فکرِ خود را محدود نکنید. در موردِ مشکلتان، از دیگران سؤال کنید و از پاسخ‌هایشان برای تولیدِ ایده‌های جدید استفاده کنید. ایده‌ها را هر چند خنده‌دار لیست کنید. ایده‌های جدید را با هم ترکیب کنید و در دسته‌های مختلف گروه‌بندی کنید. ایده‌ها را ارزیابی نکنید، یعنی هر چیزی به نظرتان رسید، فکر نکنید مسخره است یا عملی نیست. تشویق در ایده دادن و لیست کردنِ آن‌ها، در تولیدِ انبوهی ایده بسیار مؤثر خواهد بود. از بینِ ایده‌ها بهترین را پیدا کنید. به هدف و معیارهایتان توجه کنید. ایده‌های جمع شده را بر اساسِ آن‌ها تجزیه و تحلیل کنید. نقاطِ ضعفِ هر ایده را پیدا کنید و فکر کنید چگونه می‌توان آن‌ها را به نقطه‌ی قوت تبدیل کرد. در مورد نقاطِ مثبت اغراق کنید، شما را در اجرای ایده‌تان دل‌گرم می‌کند. ایده را به راه‌حلِ عملی تبدیل کنید. بعد از ارزیابی و انتخابِ بهترین ایده، حالا وقتِ این است که به عملی کردنِ ایده فکر کنید. این مرحله‌ای است که فکر و ذهنیتِ شما می‌خواهد به یک چیزِ جدی تبدیل شود. یک ایده‌ی خوب اگر بد اجرا شود نه تنها سودی ندارد، بلکه گاهی موجب زیان‌های جبران ناپذیر می‌شود.

من یک سنت پیدا کردم

من یک سنت پیدا کردم روزی پسر بچه ای در خیابان سکه ای یک سنتی پیدا کرد. او از پیدا کردن این پول، آن هم بدون هیچ زحمتی، خیلی ذوق زده شد. این تجربه باعث شد که بقیه روزها هم با چشمهای باز، سرش را به سمت پایین بگیرد ( به دنبال گنج !). او در مدت زندگیش، 296 سکه یک سنتی، 48 سکه 5 سنتی، 19 سکه 10 سنتی، 16 سکه 25 سنتی، 2 سکه نیم دلاری و یک اسکناس مچاله شده 1 دلاری پیدا کرد. یعنی در مجموع 13 دلار و 26 سنت. در برابر به دست آوردن این 13 دلار و 26 سنت، او زیبایی دل انگیز 31369 طلوع خورشید، در خشش 157 رنگین کمان و منظره درختان افرا در سرمای پاییز را از دست داد. او هیچگاه حرکت ابرهای سفید را بر فراز آسمان، در حالی که از شکلی به شکل دیگر در می آمدند، ندید. پرندگان در حال پرواز، در خشش خورشید و لبخند هزاران رهگذر، هرگز جزئی از خاطرات او نشد.

دو فرشته

دو فرشته دو فرشته مسافر، برای گذراندن شب، در خانه یک خانواده ثروتمند فرود آمدند. این خانواده رفتار نامناسبی داشتند و دو فرشته را به مهمانخانه مجللشان راه ندادند، بلکه زیرزمین سرد خانه را در اختیار آنها گذاشتند. فرشته پیر در دیوار زیر زمین شکافی دید و آن را تعمیر کرد. وقتی که فرشته جوان از او پرسید چرا چنین کاری کرده، او پاسخ داد:" همه امور بدان گونه که می نمایند نیستند." شب بعد، این دو فرشته به منزل یک خانواده فقیر ولی بسیار مهمان نواز رفتند. بعد از خوردن غذایی مختصر، زن و مرد فقیر، رختخواب خود را در اختیار دو فرشته گذاشتند. صبح روز بعد، فرشتگان، زن و مرد فقیر را گریان دیدند. گاو آنها که شیرش تنها وسیله گذران زندگیشان بود، در مزرعه مرده بود. فرشته جوان عصبانی شد و از فرشته پیر پرسید:" چرا گذاشتی چنین اتفاقی بیفتد؟ خانواده قبلی همه چیز داشتند و با این حال تو کمکشان کردی، اما این خانواده دارایی اندکی دارند و تو گذاشتی که گاوشان هم بمیرد." فرشته پیر پاسخ داد:"وقتی در زیر زمین آن خانواده ثروتمند بودیم، دیدم که در شکاف دیوار کیسه ای طلا وجود دارد. از آنجا که آنان بسیار حریص و بد دل بودند، شکاف را بستم و طلاها را از دیدشان مخفی کردم. دیشب وقتی در رختخواب زن و مرد فقیر خوابیده بودیم، فرشته مرگ برای گرفتن جان زن فقیر آمد و من به جایش آن گاو را به او دادم. همه امور بدان گونه که می نمایند نیستند و ما گاهی اوقات، خیلی دیر به این نکته پی می بریم."

هات داگ با انگشت اشاره

هات داگ با انگشت اشاره صف طولانی سفارش غذا در مک دونالد، آنهم روز یکشنبه آنقدر اعصابم را خرد کرده بود که چند بار تصمیم گرفتم عطایش را به لقایش ببخشم و بروم. هروله جماعت برای پیدا کردن صفی کوتاه تر و انتخاب غذاها با صدای بلند که شاید اشتهاشان را بیشتر باز می کرد هم بر شلوغی آنجا می افزود. اتاق کناری که با شیشه، دیوارش کرده بودند و بچه ها با اسباب بازی های مک دونالدی بازی می کردند آنقدر صدا تولید کرده بود که صدای ملچ و مولوچ بزرگترها و آروقهاشان تقریبا بنظر نمی رسید. بچه‌ها می خندیدند و از سرسره پایین می آمدند. چیزی که من هرچه فکر می کردم دلیلی برای آنهمه خندیدنش نمی یافتم. ترجیح دادم حواسم بیشتر به صدای خوردن بزرگترها باشد که درکش برایم خیلی راحت تر بود. نفر جلویی‌ام مردی بود میان سال که دختر بچه دو سه ساله‌اش را بغل گرفته بود. دخترک سرش را روی شانه پدر ول کرده بود و با حسرت به اتاق شیشه‌ای نگاه می کرد. احساس کردم تمام آرزویش از این دنیا، تنها بودن در آن اتاق است. تمام حواسش به صدای بچه ها بود و خنده هاشان. اما تلاشی هم برای ملحق شدن به جمع آنها نمی کرد. شاید هم قبلا تلاشهایش را برای رسیدن به تنها آرزویش در این عالم کرده و ثمره اش تنها نصیحت های آمرانه پدر بوده. دلم می خواست آرزویش را براورده کنم. چه جرمی کرده که باید از حالا صدای خوردن و آروق زدن بزرگترها را بشنود ؟ با خودم خیلی کلنجار رفتم و بالاخره تقه ای روی شانه مرد میان سال زدم. لبخندی مصنوعی روی صورتم کاشتم و همچنان که با انگشت اشاره اتاق شیشه ای را نشان می دادم گفتم: "بزار بره بازی کنه" دخترک سرش را برداشت و از جهت انگشت منظورم را فهمید. خوشش آمده بود که کسی هم توی عالم آدم گنده ها برایش شده غول چراغ جادو. اما پدر با نگاهی دلهره وار به اتاق و شلوغی آن تنها به گفتن "نه متشکرم" بسنده کرد. حالا دیگر دختر تنها، من را نگاه میکرد. لبخندی زدم، با لبخندی پاسخ داد. شروع کردم به ادا دراوردن. چشمم را چپ می کردم. لبو لوچه‌ام را بالا و پایین می کردم. گردنم را می چرخاندم. دخترک هم بلند بلند می خندید. آنقدر که چند بار نفسش بالا نیامد. حسابی جو گیر شده بودم. بالا و پایین می پریدم. فقط چشمان او برایم مهم بود. برایم اهمیتی نداشت چشمان بزرگتری که دارند از تعجب گرد می شوند. دخترک هم با معرفت بود. بلند بلند می خندید و نگاهش را بر نمی داشت و وقتی آرام می شدم با صدایی دوباره من را به ادامه دلقک بازی تشویق می کرد. نوبت به آنها رسید. مرد میانسال غذا را گرفت و رفت گوشه ای نشست. اما هنوز دخترک نگاهش دنبال من بود. من از همان جا برایش ادا می فرستادم و او هم آنقدر بلند می خندید که بتوانم صدایش را بشنوم. هات داگم را که گرفتم رفتم و روی صندلی کناریشان نشستم. دخترک خوشحال شد که کنارش آمدم. دست بردار نبودم. یک لقمه ساندویچ و چهار پنج دقیقه ادا و مسخره بازی برای دخترک. پدرش هم از فرصت استفاده می کرد و بزور توی دهان دخترش سیب زمینی سرخ کرده می چپاند و با لبخندی هم اعلام رضایت می کرد. تقریبا انتهای غذایم بود که دخترک آرام شد. انگشتش را طرف صورتم گرفت و خیلی جدی نگاهم کرد. دوباره ادا درآوردم ولی نخندید و انگشتش را گذاشت دهانش. وقتی بر مسخره بازی اصرار می کردم اعصابش خرد می شد. انگشت اشاره اش را طرف صورتم پرت می کرد و دوباره توی دهانش می گذاشت. گیج شده بودم. تمام اداهایی که تا چند لحظه پیش با آنها صدای خنده اش رستوران را برداشته بود کمترین تاثیری رویش نداشت. اصرار دخترک بر نشان دادن انگشت اشاره و بعد گذاشتنش در دهان بیشتر شده بود. نمی فهمیدم چه می خواهد. به فکرم رسید که شاید منظورش خوردن کمی از غذای من باشد. یک دانه سیب زمینی سرخ کرده بردم سمت صورتش ولی با پشت دست روی زمین انداخت. چیزهایی می گفت. شاید به همان زبان عالم زر که دیگر یادم رفته بود. احتمالا فحش هم میداده که چرا نمی فهمم زبانش را و یا چرا یادم رفته زبان مادری ام را. حواسم را جمع کردم که چه ارتباطی بین انگشت اشاره و دهان وجود دارد. توی افکارم کمی گشتم و یک چیز دیگر یافتم. شاید می خواهد ببوستم؟ با خنده زیر لب گفتم: شنیده بودم دخترای امروزی زود به بلوغ فکری میرسن اما دیگه نه تو سن و سال تو. ولی چاره ای هم نداشتم معتاد صدای خنده هایش شده بودم. حتی به قیمت نظاره کردن چشمهای بزرگترها. صورتم را نزدیک لبانش کردم آنقدر که دم و بازدم سریعش را روی گونه هایم حس می کردم. دخترک کمی مات مانده بود و بعد از چند ثانیه اصرار من بر نگه داشتن گونه هایم در کنار لبش، دو دستش را بالا آورد و چنان کوبید روی سرم که از درد دستش گریه اش بلند شد.بیچاره شوهرش... مرد میان سال هم با نگاهی ابراز معذرت خواهی کرد. و با چند بار بالا و پایین انداختن دخترک در بغلش دوباره آرامش کرد. دخترک هم سرش را ول کرد روی شانه پدر. سرم را بردم پایین و دوباره کمی ادا دراوردم اما دخترک اعتنایی نمی کرد. ای کاش می دانستم که آرزوی الانش از دنیای آدم گنده ها چیست که برایش براورده کنم. به هر قیمتی. اما نمی فهمیدم. غذایم هم تقریبا تمام شده بود. لقمه آخر انگار زهر مار بود که با زور نوشابه فرستادمش پایین. بلند شدم. از صدای حرکت صندلی دخترک متوجه خیال رفتنم شد. سرش را بلند کرد. توی صورتش نگرانی موج میزد. انگار تمام غصه های عالم در دل کوچکش خانه کرده اند. لبانش نشان می داد بزحمت دارد بغضش را نگه می دارد که دوباره بالا و پایین رفتن‌ها در بغل پدرش را تحمل نکند. با نا‌امیدی و التماس دوباره انگشت اشاره اش را بطرف صورتم گرفت و بعد هم در دهانش گذاشت. دیگر نمی توانستم تحمل کنم. احساس گناهی مثل همان گناه‌های دنیای آدم گنده ها؛ داشت بیچاره ام می کرد. بسرعت به سمت درب خروج رفتم. سنگینی فشار بدرقه چشمان دخترک را به خوبی روی شانه هایم احساس می کردم. در را که باز کردم صدای گریه اش بلند شد. اما بهتر دیدم با همان پرتابهای توی بغل پدرش آرام شود. عرض خیابان را بدون توجه به بوقهای ممتد و داد و بیدادهای راننده ها رد کردم. باید زودتر از آنجا دور می شدم. اولین اتوبوس را بدون توجه به مقصد سوار شدم و روی صندلی کنار پنجره تنم را ول کردم. سرم را گرم دنیای آدم بزرگها کردم، شاید که یادم برود انگشت کوچک اشاره اش را. شیشه تمیز بود. آنقدر سابیده بودندش که راحت می توانستم مثل آینه خودم را در آن ببینم. و دیدم... دیدم آنچه را که دخترک آنهمه نگرانش بود. انگشت اشاره ام را بالا آوردم. لکه سس گوجه فرنگی را از چانه ام گرفتم و توی دهانم گذاشتم.

سه ابزار متفاوت برای سودمندتر کردن USB Drive ها

همیشه در مورد حفاظت اطلاعات در مقابل دزدی ها و سوء استفاده ها بحث هایی بوده است و اهمیت آن ها بر همگان آشکار است. پنهان کردن و رمز دار کردن درست اطلاعات، یکی از بهترین روش ها برای جلوگیری از این خراب کاری های است. برنامه USB Safeguard یکی از بهترین ها در این زمینه است. سیستم رمز گذاری این برنامه بر طبق سیستم AES 256 می باشد که امنیت اطلاعات شما را تضمین می کند. تنها کاری که برای نصب این برنامه بر روی فلش مموری خود دارید، این است که فایل قابل اجرا را از سایت اصلی برنامه، دریافت کنید و آن را بر روی USB Drive کپی کرده و رمز عبور خود را تعریف نمایید. نکته قابل ذکر در این جا این است که باید به یاد داشته باشید که مقدار کمی از فضای فلش مموری خود را برای فایل های اصلی خود برنامه باید اختصاص دهید و آن ها را هیچ گاه حذف نکنید. عکس از makeuseof.com   برنامه این اختیار را به شما می دهد که به جای رمزگذاری تمام فایل های فلش مموری، تنها فایل ها و محتوای دلخواه خود را رمز گذاری کنید. همچنین می توانید رمز عبور را در یک فایل جداگانه ذخیره کنید تا در زمان فراموشی رمز، از آن استفاده کنید. به خاطر داشته باشید که در صورت فراموشی رمز عبور، اطلاعات به هیچ وجه قابل بازیابی نیست! پس از رمز گذاری فایل ها، برنامه به شما اجازه می دهد تا در صورت تمایل، فایل های اصلی و رمزگذاری نشده خام را در جای دیگر کپی و یا به اشتراک بگذارید. عکس از makeuseof.com USB Agent این برنامه جالب کاربر را قارد می سازد تا برنامه های دلخواه را پس از اتصال فلش مموری به رایانه، باز نماید و یا Batch file های از پیش تعریف شده را اجرا کند. به طور مثال می توانید تعیین کنید که پس از اتصال، مرورگر اینترنت باز شود و به سایت های مختلف بروید. قابلیت برتر این برنامه این است که می توانید یک یا چند batch file را اجرا نمایید. همان طور که می دانید این نوع فایل ها، قدرت بسیار زیادی دارند و می توان کارهایی عجیب توسط آن ها انجام داد.   عکس از makeuseof.com این برنامه به کمی تنظیمات احتیاج دارد و لازم است که شما فایلی با نام “usbagent.inf” شامل محتویات زیر ایجاد کنید: [usb agent]ON = OFF = برنامه هایی که در جلوی آن ها گزینه ON قرار دارد به هنگام اتصال، اجرا می شوند و گزینه OFF برنامه های انتخابی در جلوی آن را به هنگام قطع فلش مموری، می بندد. اطلاعات بیشتر را می توانید از سایت های زیر دریافت کنید.   http://www.withopf.com/tools/usbagent/http://translate.google.co.in/translate?hl=en&sl=de&u=http://www.withopf.com/tools/usbagent/     USB Dumper این برنامه در نوع خود بسیار جالب است و به شما کمک می کند تا به هنگام اتصال فلش مموری به رایانه، محتویات موجود در فلش مموری را در رایانه کپی کند و به نوعی از آن ها پشتیبان تهیه کند. فقط USB Drive را به رایانه متصل کنید و USB Dumper به طور اتوماتیک فایل های موجود در USB Drive را در دایرکتوری معین شده کپی می کند. لازم به ذکر است که پشتیبان ایجاد شده توسط این برنامه در پوشه ای که تاریخ آن روز، به عنوان اسم انتخاب شده است، کپی می شود.   عکس از makeuseof.com نکته جالبی که در ادمه باید به آن اشاره کنیم این است که از این برنامه تنها برای تهیه پشتیبان استفاده نمی شود. از این برنامه برای کپی اطلاعات از فلش مموری بر روی سیستم بدون آگاهی کاربر نیز می توان استفاده کرد. ممکن است آنتی ویروس موجود بر روی سیستم، این برنامه را Block کند و یا بدافزار شناسایی کند اما از این برنامه همان طور که گفته شد می توان در راه مثبت استفاده کرد (توصیه می کنیم که در راه مثبت از این برنامه استفاده کنید).

Abstract

AbstractA semi-automated method for amino acid derivatization and analysis has been validated for use in analysis of protein biopharmaceuticals. The method includes protein hydrolysis, o-phthalaldehyde derivatization, and reversed-phase high-performance liquid chromatography analysis in a general-purpose UV-visible high-performance liquid chromatography system. Amino-acid derivatization is performed automatically by the high-performance liquid chromatography autosampler right before injection. The required validation parameters, i.e., specificity, linearity, accuracy, precision, limit of detection, and limit of quantification, were studied for bovine serum albumin and for a recombinant human Fab fragment. The method can be employed as an absolute quantification method for determination of extinction coefficients of recombinant proteins.Keywords: Amino acid analysis, OPA-derivatization, reverse-phase HPLC, validation Amino-acid analysis has a long history in the characterization of protein-based products, since it provides information on the product concentration without referring to an external protein standard and it is independent from the shape and the charge of the protein. In addition, the determined amino-acid composition can confirm sample identity and gives a measure of sample purity. Furthermore, when combined with absorbance measurements, it allows the determination of extinction coefficients under various conditions.1 For protein conjugates, where the synthetic counterpart modifies the protein absorption properties, amino-acid analysis may be required as the only reliable quantification method.However, in spite of these features, few laboratories can perform such analysis in a reliable and quantitative way, due to the need for specialized equipment and skills. Usually, techniques based on ion-exchange separation coupled with post-column derivatization (e.g., with nin-hydrin, the “classical” method) are considered more precise1 than those based on pre-column derivatization and reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC), because the latter techniques imply extensive sample manipulation before analysis and are affected by the limited stability of the preformed derivatives.2 However, such RP-HPLC-based methods have the advantage of being accessible to most analytical laboratories, since they do not require expensive dedicated instruments. In addition, manufacturing of dedicated instruments is being halted, making the availability of validated pre-column methods even more important.In this paper, we describe the validation of a method that takes advantage of robotic sample derivatization, thereby limiting considerably the manual manipulation of samples. Another advantage of automation is that derivatization is performed just before the injection; therefore, the time from reaction to injection is kept absolutely constant for all samples, thus avoiding differential degradation of labile derivatives. We have studied the performance characteristics in terms of specificity, linearity, accuracy, precision, limit of detection, and limit of quantification for bovine serum albumin (BSA) and for a recombinant human Fab (rFab) fragment, whose extinction coefficient needs to be determined.Protein samples were hydrolyzed, then automatically derivatized with o-phthalaldehyde (OPA) and in-line analyzed by RP-HPLC with ultraviolet-visible (UV-Vis) detection, according to a method published in an Agilent application note.3.MATERIALS AND METHODSReagents, Solvents, and MaterialsSodium phosphate monobasic monohydrate, sodium hydroxide, boric acid, acetonitrile (LC grade), and methanol (LC grade) were obtained from Merck KGaA (Darmstadt, Germany). OPA reagent was prepared as described (Agilent art. 5061-3335, Palo Alto, CA). Borate buffer was prepared by adjusting 0.4 N boric acid to pH 10.2 with NaOH. Constant-boiling HCl was obtained from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Chromatographic-grade water was produced by a Milli-Q system (Millipore, Billerica, MA)Disposable glass test tubes (50 × 6 mm) and hydrolysis reaction vials (25 × 120 mm) with Mininert valves were from Kimble Glass, Inc., and Kontes Glass Co. (Vineland, NJ). Amber wide-opening vials, glass conical inserts with polymer feet, and screw caps were from Agilent.Albumin standard solution (2 mg/mL) was supplied by Pierce Biotechnology (Rockford, IL), while amino acid standard mixtures at the concentration of 1 nmol/μL and 250 pmol/μL were from Agilent. The internal standard l-norvaline was obtained from Sigma-Aldrich. A recombinant Fab fragment (rFab) was obtained from the research laboratories of Bracco Imaging (Milan, Italy).Amino Acid Standard SolutionsAmino acid standard samples were prepared by mixing 95 μL of the 250 pmol/μL amino acid standard mixture with 5 μL of 10 mM norvaline and analyzed directly by RP-HPLC, within 24 h from preparation. Solutions for linearity study were prepared in duplicate by diluting the 1 nmol/μL amino acid standard solution, and contained 20, 50, 130, 250, or 500 pmol/μL of amino acid standard mixture together with 0.5 mM norvaline.Protein SamplesGlass test tubes (50 × 6 mm) were marked with incisions and soaked in a detergent solution for at least 12 h. They were rinsed thoroughly in Milli-Q water and dried in an oven at 80°C. Protein samples (7–75 μg) were transferred into the glass test tubes and spiked with 0.5 mM norvaline. They were quickly spun in a low-velocity centrifuge, then frozen and dried in a lyophilizer. Samples were then transferred into the reaction vial containing 0.5 mL of constant-boiling HCl on the bottom. Up to 12 test tubes could be accommodated in a reaction vial. The reaction vial was tightly closed and transferred into a pre-heated oven at 110°C for 18 h. The reaction vial was cooled at room temperature, then carefully opened under an aspirated hood. The test tubes were centrifuged and dried again in the lyophilizer to remove any liquid traces (condensed vapors). The dried residues were dissolved in 100 μL of 0.1 N HCl and transferred into the HPLC glass insert vials.InstrumentationAnalyses were performed using an Agilent 1100 Liquid Chromatograph, equipped with a binary pump delivery system (G1312A), robotic autosampler (G1313A), column thermostat (G1316A) and multi-wavelength detector (G1365A).Analytical ProcedureChromatography conditions were in accordance with the Agilent method.2 Briefly, the hydrolyzed samples and the norvaline-spiked amino acid standard solutions were automatically derivatized with OPA by programming the robotic autosampler (Table 1). After derivatization, an amount equivalent to 2.5 μL of each sample was injected on a Zorbax Eclipse-AAA column, 5 μm, 150 × 4.6 mm (Agilent), at 40°C, with detection at λ = 338 nm. Mobile phase A was 40 mM NaH2PO4, adjusted to pH 7.8 with NaOH, while mobile phase B was acetonitrile/methanol/ water (45/45/10 v/v/v). The separation was obtained at a flow rate of 2 mL/min with a gradient program that allowed for 1.9 min at 0% B followed by a 16.3-min step that raised eluent B to 53%. Then washing at 100% B and equilibration at 0% B was performed in a total analysis time of 26 min.TABLE 1Autosampler Programming InstructionsRESULTS AND DISCUSSIONAcid hydrolysis is a crucial step that considerably influences amino-acid recovery. In fact, during acid hydrolysis, tryptophan and cysteine are destroyed and serine and threonine are also partially lost, while methionine can undergo oxidation. Moreover, some amino acids such as glycine and serine are common contaminants; therefore, their quantification needs careful subtraction of average responses in blank runs, which, in the case of glycine, is also complicated by the fact that this residue is known to give rise to multiple derivatives after OPA reaction.2 Therefore, the validation parameters were estimated using the following seven best-recovered amino acids: Asx (Asn+Asp), Glx (Glu+Gln), Arg, Ala, Phe, Leu, and Lys.4In order to fully assess the method’s performance, both a standard amino acid mixture and a reference protein (e.g., BSA) should be assayed along with the product. The standard amino acid mixture (Figure 1​1)) enables the verification of the HPLC method’s performance, including derivatization, while the reference protein samples(Figure 2​2)) assess the completeness of the hydrolysis step. In addition, L-norvaline, which is added as the internal standard, provides a control for sample-to-sample variability.FIGURE 1Example of a standard amino acid mixture analysis at a concentration of 250 pmol/μl.FIGURE 2Example of a protein hydrolysate analysis for one of the 35-μg BsA samples.SpecificitySpecificity was documented by comparing retention times obtained in the standard amino acid mixture (five samples) with those obtained from the reference protein samples (three samples). Results are reported in Table 2. The minimal difference between retention times (